Nature.com сайтаар зочилсонд баярлалаа.Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS-ийн дэмжлэгтэй байна.Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer-д нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох).Энэ хооронд байнгын дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг ямар ч загвар, JavaScript-гүйгээр үзүүлэх болно.
Уушигны цистик фиброзын эмчилгээний генийн векторууд нь дамжуулагч амьсгалын замд чиглэгдэх ёстой, учир нь уушгины захын дамжуулалт нь эмчилгээний үр нөлөөгүй байдаг.Вирусын дамжуулалтын үр ашиг нь тээвэрлэгчийн оршин суух хугацаанаас шууд хамаардаг.Гэсэн хэдий ч ген тээгч гэх мэт дамжуулах шингэн нь амьсгалах үед цулцангийн хөндий рүү байгалийн жамаар тархдаг бөгөөд ямар ч хэлбэрийн эмчилгээний хэсгүүд нь салст бүрхүүлийн тээвэрлэлтээр хурдан арилдаг.Амьсгалын замд генийн тээвэрлэгчдийн оршин суух хугацааг уртасгах нь чухал боловч хүрэхэд хэцүү байдаг.Амьсгалын замын гадаргуу руу чиглүүлж болох зөөвөрлөгч-коньюгат соронзон хэсгүүд нь бүс нутгийн зорилтот байдлыг сайжруулж чадна.Амьсгалын замын гадаргуу дээрх ийм жижиг соронзон хэсгүүдийн нөлөөллийг in vivo дүрслэлтэй холбоотой асуудлаас болж хэрэглэж буй соронзон орон байгаа нөхцөлд сайн ойлгодоггүй.Энэхүү судалгааны зорилго нь дан болон бөөн бөөмсийн динамик, зан үйлийн хэв маягийг судлахын тулд мэдээ алдуулалтанд орсон хархны гуурсан хоолой дахь соронзон хэсгүүдийн хөдөлгөөнийг in vivo байдлаар дүрслэхийн тулд синхротрон дүрслэлийг ашиглах явдал байв.Дараа нь бид соронзон орон байгаа үед лентивирусын соронзон хэсгүүдийг хүргэх нь хархны гуурсан хоолойн дамжуулалтын үр ашгийг нэмэгдүүлэх эсэхийг үнэлэв.Синхротрон рентген зураглал нь хөдөлгөөнгүй болон хөдөлгөөнт соронзон орон дахь соронзон хэсгүүдийн үйлдлийг in vitro болон in vivo байдлаар харуулдаг.Соронз ашиглан амьд амьсгалын замын гадаргуу дээгүүр бөөмсийг хялбархан чирэх боломжгүй боловч тээвэрлэх явцад ордууд нь соронзон орон хамгийн хүчтэй байдаг харааны талбарт төвлөрдөг.Соронзон орон байгаа нөхцөлд лентивирусын соронзон хэсгүүдийг дамжуулах үед дамжуулалтын үр ашгийг 6 дахин нэмэгдүүлсэн.Эдгээр үр дүнг нэгтгэн үзвэл лентивирусын соронзон хэсгүүд болон соронзон орон нь in vivo дамжуулагч амьсгалын зам дахь генийн векторын зорилтот болон дамжуулалтын түвшинг сайжруулахад үнэ цэнэтэй арга байж болохыг харуулж байна.
Цистик фиброз (CF) нь CF трансмембран дамжуулагч зохицуулагч (CFTR) гэж нэрлэгддэг нэг генийн өөрчлөлтөөс үүсдэг.CFTR уураг нь цистик фиброзын эмгэг жамын гол хэсэг болох амьсгалын зам зэрэг биеийн олон хучуур эдийн эсүүдэд байдаг ионы суваг юм.CFTR-ийн согог нь усны хэвийн бус тээвэрлэлт, амьсгалын замын гадаргуугийн шингэн алдалт, амьсгалын замын гадаргуугийн шингэний давхарга (ASL) гүн буурахад хүргэдэг.Энэ нь мөн амьсгалын замын тоосонцор болон эмгэг төрүүлэгч бичил биетүүдээс амьсгалын замыг цэвэрлэх салст бүрхүүлийн тээвэрлэлтийн (MCT) системийг сулруулдаг.Бидний зорилго бол CFTR генийн зөв хуулбарыг хүргэх, ASL, MCT, уушгины эрүүл мэндийг сайжруулах лентивирус (LV) генийн эмчилгээг хөгжүүлэх, эдгээр үзүүлэлтүүдийг in vivo1 хэмжиж чадах шинэ технологийг үргэлжлүүлэн хөгжүүлэх явдал юм.
LV векторууд нь цистик фиброзын генийн эмчилгээнд тэргүүлэх нэр дэвшигчдийн нэг бөгөөд эмчилгээний генийг амьсгалын замын суурь эсүүдэд (амьсгалын замын үүдэл эс) бүрмөсөн нэгтгэж чаддаг.Энэ нь цистик фиброзтой холбоотой амьсгалын замын гадаргуугийн функциональ генийн залруулгатай эсүүд болон ялгарах замаар хэвийн чийгшил, салстын цэвэршилтийг сэргээж, насан туршийн үр өгөөжийг өгдөг учраас энэ нь чухал юм.CF-д уушигны оролцоо эндээс эхэлдэг тул LV векторууд нь дамжуулагч амьсгалын замын эсрэг чиглэсэн байх ёстой.Векторыг уушгины гүнд хүргэх нь цулцангийн дамжуулалтыг үүсгэж болох боловч энэ нь цистик фиброзын үед эмчилгээний нөлөө үзүүлэхгүй.Гэсэн хэдий ч генийн тээвэрлэгч зэрэг шингэн нь төрсний дараа амьсгалахад байгалийн цулцангийн хөндий рүү шилждэг3,4 эмчилгээний хэсгүүд нь MCT-ээр амны хөндий рүү хурдан гадагшилдаг.LV дамжуулалтын үр ашиг нь эсийн шингээлтийг хангахын тулд вектор зорилтот эсүүдтэй ойр байх хугацаатай шууд холбоотой байдаг - "оршин суух хугацаа" 5 нь ердийн бүс нутгийн агаарын урсгал, түүнчлэн салиа болон MCT хэсгүүдийн зохицуулалттай шингээлтээр амархан богиносдог.Цистик фиброзын хувьд амьсгалын замд LV оршин суух хугацааг уртасгах чадвар нь энэ хэсэгт өндөр дамжуулалтыг бий болгоход чухал ач холбогдолтой боловч өнөөг хүртэл бэрхшээлтэй байсаар байна.
Энэ саадыг даван туулахын тулд LV соронзон хэсгүүд (MPs) нь нэмэлт хоёр аргаар тусалж чадна гэж бид санал болгож байна.Нэгдүгээрт, тэдгээрийг соронзоор амьсгалын замын гадаргуу руу чиглүүлж, зорилтот байдлыг сайжруулж, генийн тээвэрлэгч хэсгүүдийг амьсгалын замын зөв хэсэгт байрлуулахад тусалдаг;ба ASL) эсийн давхарга руу шилжинэ 6. Парламентууд нь эсрэгбие, хими эмчилгээний эм эсвэл бусад жижиг молекулуудтай холбогдож, эсийн мембрантай холбогдож, эсийн гадаргуугийн рецептортой холбогдож, хавдрын голомтод хуримтлагдах үед эм дамжуулах зорилтот хэрэгсэл болгон өргөнөөр ашигладаг. статик цахилгаан байгаа эсэх.Хорт хавдрын эмчилгээний соронзон орон 7. Бусад "гипертермик" аргууд нь хэлбэлзэлтэй соронзон орны нөлөөлөлд өртөх үед MP-ийг халаах замаар хавдрын эсийг устгахад чиглэгддэг.Соронзон талбарыг ДНХ-ийн эс рүү шилжүүлэхийг сайжруулахын тулд трансфекцийн агент болгон ашигладаг соронзон трансфекцийн зарчмыг ихэвчлэн вирусын болон вирусын бус генийн векторуудыг ашиглан шилжүүлэн суулгахад хэцүү эсийн шугамд ашигладаг in vitro ашигладаг. ..Статик соронзон орны дэргэд LV MP-ийг in vitro хэлбэрээр хүний ​​гуурсан хоолойн хучуур эдийн эсийн шугамд оруулах замаар LV соронзон дамжуулалтын үр ашгийг тогтоож, дамжуулалтын үр ашгийг дан LV вектортой харьцуулахад 186 дахин нэмэгдүүлсэн.Цистик фиброзын in vitro загварт LV MT-ийг мөн хэрэглэсэн бөгөөд соронзон дамжуулалт нь цистийн фиброзын цэр байгаа тохиолдолд агаар-шингэний интерфэйсийн өсгөвөрт LV дамжуулалтыг 20 дахин нэмэгдүүлсэн10.Гэсэн хэдий ч in vivo эрхтэний соронзон дамжуулалт харьцангуй бага анхаарал хандуулсан бөгөөд зөвхөн цөөн тооны амьтдын судалгаанд үнэлэгдсэн байдаг11,12,13,14,15, ялангуяа уушгинд16,17.Гэсэн хэдий ч цистик фиброзын үед уушгины эмчилгээнд соронзон дамжуулалт хийх боломжууд тодорхой байна.Тан нар.(2020) "Соронзон нано бөөмсийг уушигны үр дүнтэй хүргэх талаар баталгаажуулах судалгаа нь цистик фиброзтой өвчтөнд эмнэлзүйн үр дүнг сайжруулахын тулд CFTR-ийн ирээдүйн амьсгалын стратегийн замыг нээх болно" гэж мэдэгджээ.
Хэрэглэсэн соронзон орон байгаа үед амьсгалын замын гадаргуу дээрх жижиг соронзон хэсгүүдийн зан төлөвийг төсөөлөх, судлахад хэцүү байдаг тул тэдгээрийг сайн ойлгодоггүй.Бусад судалгаануудад бид хийн сувгийн гадаргуугийн чийгшлийг шууд хэмжихийн тулд ASL18 гүн болон MCT19-ийн зан төлөвийн минутын in vivo өөрчлөлтийн тоо хэмжээг тодорхойлох, инвазив бус дүрслэлд зориулсан синхротрон тархалтад суурилсан фазын тодосгогч рентген дүрслэл (PB-PCXI) аргыг боловсруулсан. эмчилгээний үр дүнгийн эхний үзүүлэлт болгон ашигладаг.Нэмж дурдахад, манай MCT онооны арга нь хөнгөн цагааны исэл эсвэл өндөр хугарлын илтгэгч шилээс бүрдсэн 10-35 микрон диаметртэй хэсгүүдийг PB-PCXI21-д харагдах MCT маркер болгон ашигладаг.Энэ хоёр арга нь парламентын гишүүдийг оролцуулан олон төрлийн бөөмийн дүрслэлийг авахад тохиромжтой.
Орон зайн болон цаг хугацааны өндөр нарийвчлалтай учраас манай PB-PCXI-д суурилсан ASL болон MCT шинжилгээ нь дан болон бөөн бөөмсийн динамик, зан үйлийн хэв маягийг in vivo судлахад маш тохиромжтой бөгөөд MP генийг дамжуулах аргыг ойлгох, оновчтой болгоход тусалдаг.Бидний энд хэрэглэж буй арга нь SPring-8 BL20B2 цацрагийн шугамыг ашиглан хийсэн судалгаагаар хулганын хамрын болон уушгины амьсгалын замд дамми векторыг тунгаар оруулсны дараа шингэний хөдөлгөөнийг дүрслэн харуулсан бөгөөд бидний ажиглагдсан генийн илэрхийлэлийн хэв маягийг тайлбарлахад туслах болно. бидний генд.тээгч тунгаар амьтны судалгаа 3.4 .
Энэхүү судалгааны зорилго нь PB-PCXI синхротроныг ашиглан амьд хархны цагаан мөгөөрсөн хоолой дахь парламентын гишүүдийн хөдөлгөөнийг in vivo байдлаар дүрслэх явдал байв.Эдгээр PB-PCXI дүрслэлийн судалгаа нь MP-ийн хөдөлгөөнд үзүүлэх нөлөөг тодорхойлохын тулд MP цуврал, соронзон орны хүч, байршлыг турших зорилготой юм.Гадны соронзон орон нь хүргэгдсэн MF-д үлдэх эсвэл зорилтот хэсэгт шилжихэд тусална гэж бид таамагласан.Эдгээр судалгаанууд нь тунадасжилтын дараа гуурсан хоолойд үлдсэн хэсгүүдийн хэмжээг нэмэгдүүлэх соронзны тохиргоог тодорхойлох боломжийг бидэнд олгосон.Хоёрдахь цуврал судалгаанд бид амьсгалын замын зорилтот контекст дэх LV-MP-ийг хүргэх нь үр дүнд хүрнэ гэсэн таамаглал дээр LV-MPs-ийг амьсгалын замд in vivo хүргэх үр дүнд бий болсон дамжуулалтын загварыг харуулахын тулд энэхүү оновчтой тохиргоог ашиглахыг зорьсон. LV дамжуулалтын үр ашгийг нэмэгдүүлсэн..
Амьтны бүх судалгааг Аделаидын Их Сургууль (M-2019-060 ба M-2020-022) болон SPring-8 Synchrotron амьтны ёс зүйн хорооноос баталсан протоколын дагуу явуулсан.Туршилтыг ARRIVE-ийн зөвлөмжийн дагуу хийсэн.
Бүх рентген зургийг Япон дахь SPring-8 синхротрон дээрх BL20XU цацрагийн шугам дээр өмнө нь тайлбарласантай төстэй тохиргоог ашиглан авсан21,22.Товчхондоо, туршилтын хайрцаг нь синхротрон хадгалах цагирагаас 245 м зайд байрладаг.Фазын тодосгогч нөлөөг бий болгохын тулд дээжээс детектор хүртэлх 0.6 м-ийн зайг бөөмийн дүрслэлийн судалгаанд, 0.3 м-ийн in vivo дүрслэлийн судалгаанд ашигладаг.25 кВ-ын энергитэй монохромат цацраг ашигласан.Зургийг sCMOS детектортой холбосон өндөр нарийвчлалтай рентген хувиргагч (SPring-8 BM3) ашиглан авсан.Хөрвүүлэгч нь 10 μм зузаантай сцинтиллятор (Gd3Al2Ga3O12) ашиглан рентген туяаг үзэгдэх гэрэл болгон хувиргаж, дараа нь ×10 (NA 0.3) микроскопын объектив ашиглан sCMOS мэдрэгч рүү чиглүүлдэг.sCMOS илрүүлэгч нь Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япон) 2048 × 2048 пикселийн массив, 6.5 × 6.5 микрон пикселийн хэмжээтэй байв.Энэ тохиргоо нь 0.51 μm-ийн үр дүнтэй изотроп пикселийн хэмжээ, ойролцоогоор 1.1 мм × 1.1 мм-ийн харах талбарыг өгдөг.Амьсгалын замын доторх болон гадна талын соронзон хэсгүүдийн дохио-дуу чимээний харьцааг нэмэгдүүлэхийн зэрэгцээ амьсгалын улмаас үүссэн хөдөлгөөнийг багасгахын тулд 100 мс-ийн өртөх хугацааг сонгосон.In vivo судалгаанд өртөх хооронд рентген туяаг хааж цацрагийн тунг хязгаарлах зорилгоор рентген туяаны замд хурдан рентген хаалт байрлуулсан.
BL20XU зургийн камер нь Биоаюулгүй байдлын 2-р түвшний гэрчилгээгүй тул SPring-8 PB-PCXI дүрслэлийн судалгаанд LV медиаг ашиглаагүй.Үүний оронд бид шилэн хялгасан судсан дахь парламентын гишүүдийн хөдөлгөөнд соронзон орон хэрхэн нөлөөлдөгийг ойлгохын тулд эхлээд төрөл бүрийн хэмжээ, материал, төмрийн агууламж, хэрэглээ зэргийг хамарсан хоёр арилжааны үйлдвэрлэгчээс сайн шинж чанартай парламентын гишүүдийг сонгосон. амьд амьсгалын замууд.гадаргуу.MP-ийн хэмжээ нь 0.25-18 микрон хооронд хэлбэлздэг бөгөөд янз бүрийн материалаар хийгдсэн байдаг (Хүснэгт 1-ийг үз), гэхдээ дээж бүрийн найрлага, түүний дотор MP дахь соронзон хэсгүүдийн хэмжээ тодорхойгүй байна.Бидний MCT-ийн 19, 20, 21, 23, 24-ийн өргөн цар хүрээтэй судалгаан дээр үндэслэн бид гуурсан хоолойн амьсгалын замын гадаргуу дээр 5 μм хүртэлх хэмжээтэй парламентын гишүүдийг харж болно гэж найдаж байна, жишээлбэл, MP-ийн хөдөлгөөний харагдах байдлыг сайжруулахын тулд дараалсан хүрээг хасах замаар.0.25 μм-ийн нэг МП нь дүрслэх төхөөрөмжийн нягтралаас бага боловч PB-PCXI нь тэдгээрийн эзлэхүүний тодосгогч байдал болон хуримтлагдсаны дараа хуримтлагдсан гадаргуугийн шингэний хөдөлгөөнийг илрүүлэх төлөвтэй байна.
Хүснэгтэнд байгаа УИХ-ын гишүүн бүрийн дээж.1-ийг 0.63 мм-ийн дотоод диаметр бүхий 20 мкл шилэн хялгасан судсанд (Drummond Microcaps, PA, USA) бэлтгэсэн.Корпускуляр тоосонцор нь усанд байдаг бол CombiMag тоосонцор нь үйлдвэрлэгчийн тусгай шингэнд байдаг.Хоолой бүрийг хагас шингэнээр (ойролцоогоор 11 мкл) дүүргэж, дээж эзэмшигч дээр байрлуулна (1-р зургийг үз).Шилэн хялгасан судсыг дүрсний камерт тайзан дээр хэвтээ байдлаар тус тус байрлуулж, шингэний ирмэг дээр байрлуулсан.Ховор шороо, неодим, төмөр, бороор (NdFeB) (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австрали) хийсэн 19 мм диаметртэй (28 мм урт) никель бүрхүүлтэй соронзыг 1.17 Т үлдэгдлээр бэхэлсэн. хүрэхийн тулд тусдаа дамжуулах хүснэгтийг дүрслэх явцад байрлалаа алсаас өөрчлөх.Соронзыг дээжээс 30 мм-ийн өндөрт байрлуулж, секундэд 4 фрэймийн хурдтай зураг авах үед рентген зураглал эхэлдэг.Дүрслэх явцад соронзыг шилэн капилляр хоолойд ойртуулж (ойролцоогоор 1 мм-ийн зайд) дараа нь хоолойн дагуу хөдөлж, талбайн хүч ба байрлалын нөлөөг үнэлэв.
Xy дээжийг орчуулах үе шатанд шилэн хялгасан судсан дахь MP дээжийг агуулсан in vitro дүрслэлийн тохиргоо.Рентген туяаны замыг улаан тасархай шугамаар тэмдэглэв.
УИХ-ын гишүүдийн in vitro харагдах байдлыг тогтоосны дараа тэдгээрийн нэг хэсгийг зэрлэг төрлийн Wistar альбино хархнууд дээр (~12 долоо хоногтой, ~200 гр) in vivo туршсан.Медетомидин 0.24 мг/кг (Домитор®, Зеноак, Япон), мидазолам 3.2 мг/кг (Дормикум®, Астеллас Фарма, Япон) ба буторфанол 4 мг/кг (Vetorphale®, Мэйжи Сейка).Хархыг фарма (Япон) хольцоор хэвлийн хөндийд тарьж мэдээгүйжүүлсэн.Мэдээ алдуулсны дараа гуурсан хоолойн орчмын үслэг хэсгийг авч, дотоод гуурсан хоолой (ET; 16 га судсаар хийх суваг, Терумо BCT) хийж, дулааны уут агуулсан захиалгаар хийсэн дүрсний хавтан дээр хэвтээ байрлалд хөдөлгөөнгүй болгох замаар дүрслэлд бэлтгэсэн. биеийн температурыг хадгалах.22. Дараа нь дүрсний хавтанг 2а-р зурагт үзүүлсний дагуу рентген зураг дээр гуурсан хоолойг хэвтээ байдлаар зэрэгцүүлэхийн тулд дүрсний хайрцагт байгаа дээжийн шатанд бага зэрэг өнцгөөр наасан.
(a) SPring-8 дүрслэлийн нэгж дэх in vivo дүрслэлийн тохиргоо, улаан тасархай шугамаар тэмдэглэгдсэн рентген туяа.(b,c) Гуурсан хоолойн соронзыг локалчлалыг хоёр ортогон байдлаар суурилуулсан IP камер ашиглан алсаас хийсэн.Дэлгэц дээрх зургийн зүүн талд толгойг барьж буй утас гогцоо, ET хоолой дотор суурилуулсан хүргэх сувгийг харж болно.
100 мкл шилэн тариур ашиглан алсын удирдлагатай тариурын насосны системийг (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, FL) 30 Га зүү ашиглан PE10 хоолойд (0.61 мм OD, 0.28 мм ID) холбосон.Гуурсан хоолойн төгсгөлийг оруулахдаа гуурсан хоолойд үзүүр нь зөв байрлалд байгаа эсэхийг шалгана.Микронасос ашиглан тариурын поршег салгаж, хоолойны үзүүрийг хүргэх MP дээжинд дүрнэ.Ачаалал ихтэй хүргэх хоолойг төгсгөлийн хоолойд хийж, үзүүрийг бидний хүлээгдэж буй соронзон орны хамгийн хүчтэй хэсэгт байрлуулав.Зураг авах ажиллагааг манай Arduino-д суурилсан цагны хайрцагт холбогдсон амьсгал мэдрэгч ашиглан удирдаж, бүх дохиог (жишээлбэл, температур, амьсгал, хаалтыг нээх/хаах, зураг авах) Powerlab болон LabChart (AD Instruments, Сидней, Австрали) ашиглан бүртгэсэн. 22 Дүрс авах үед орон сууц байхгүй үед хоёр IP камер (Panasonic BB-SC382) нь бие биенээсээ ойролцоогоор 90°-т байрлуулж, дүрслэх явцад гуурсан хоолойтой харьцуулахад соронзны байрлалыг хянахад ашигласан (Зураг 2b, c).Хөдөлгөөний олдворыг багасгахын тулд амьсгалын замын төгсгөлийн өндөрлөгийн үеэр амьсгал бүрт нэг дүрсийг авсан.
Соронз нь хоёр дахь шатанд бэхлэгдсэн бөгөөд энэ нь дүрсний биеийн гадна талд байрладаг.Соронзонгийн янз бүрийн байрлал, тохиргоог туршсан бөгөөд үүнд: гуурсан хоолойн дээгүүр ойролцоогоор 30 ° өнцгөөр байрлуулсан (тохиргоог 2a ба 3a зурагт үзүүлэв);нэг соронзыг амьтны дээгүүр, нөгөөг нь доор байрлуулж, таталцах зориулалттай туйлуудыг байрлуулна (Зураг 3б)., амьтны дээр нэг соронз, доор нэг соронз, түлхэлтэнд тохируулсан туйлтай (Зураг 3в), нэг соронзыг гуурсан хоолойн дээр ба перпендикуляр (Зураг 3d).Амьтан, соронзыг тохируулж, туршилтын MP-ийг тариурын шахуурга руу оруулсны дараа зураг авах үед 4 мкл/сек хурдтайгаар 50 мкл тунгаар өгнө.Дараа нь соронзыг гуурсан хоолойн дагуу эсвэл нааш цааш хөдөлгөж, зургийг үргэлжлүүлэн авдаг.
In vivo дүрслэлд зориулсан соронзны тохиргоо (a) гуурсан хоолойн дээгүүр ойролцоогоор 30° өнцгөөр нэг соронз, (б) татахаар тохируулсан хоёр соронз, (в) түлхэлтээр тохируулсан хоёр соронз, (г) нэг соронз дээрх ба перпендикуляр гуурсан хоолой.Ажиглагч амнаас уушиг руу гуурсан хоолойгоор харвал рентген туяа нь хархын зүүн талыг дайрч, баруун талаас нь гарав.Соронз нь амьсгалын замын уртын дагуу эсвэл гуурсан хоолойн дээгүүр зүүн ба баруун тийш рентген туяаны чиглэлд хөдөлдөг.
Амьсгал ба зүрхний цохилт холилдохгүй байх үед амьсгалын зам дахь тоосонцоруудын харагдах байдал, зан төлөвийг тодорхойлохыг бид эрэлхийлсэн.Иймээс зураг авах хугацаа дууссаны дараа пентобарбиталыг хэтрүүлэн хэрэглэсний улмаас амьтдыг хүний ​​аргаар устгасан (Сомнопентил, Питман-Мур, Вашингтон Кроссинг, АНУ; ~65 мг/кг ip).Зарим амьтдыг дүрслэх тавцан дээр үлдээсэн бөгөөд амьсгалах, зүрхний цохилт зогссоны дараа дүрслэх үйл явцыг давтаж, хэрэв амьсгалын замын гадаргуу дээр MP харагдахгүй бол MP-ийн нэмэлт тунг нэмнэ.
Үүссэн зургуудыг хавтгай, харанхуй талбараар засч, дараа нь MATLAB (R2020a, The Mathworks) дээр бичсэн тусгай скриптийг ашиглан кино болгон (секундэд 20 кадр; амьсгалын хурдаас хамааран 15–25 × хэвийн хурд) цуглуулсан.
LV генийн вектор дамжуулалтын талаархи бүх судалгааг Аделаидын Их Сургуулийн Лабораторийн Амьтны Судалгааны Төвд хийсэн бөгөөд соронзон орны дэргэд LV-MP дамжуулалт нь in vivo генийн дамжуулалтыг сайжруулж чадах эсэхийг үнэлэхийн тулд SPring-8 туршилтын үр дүнг ашиглахыг зорьсон. .MF ба соронзон орны нөлөөллийг үнэлэхийн тулд хоёр бүлгийн амьтдыг эмчилсэн: нэг бүлэгт соронзтой LV MF, нөгөө бүлэгт соронзонгүйгээр LV MF-тай хяналтын бүлэг тарьсан.
LV генийн векторуудыг өмнө нь тайлбарласан аргуудыг ашиглан үүсгэсэн 25, 26 .LacZ вектор нь MPSV үүсгэгч дэмжигчээр (LV-LacZ) өдөөгдсөн цөмийн орон нутгийн бета-галактозидазын генийг илэрхийлдэг бөгөөд энэ нь уушигны эд эсийн урд болон хэсэгт харагдахуйц хувирсан эсүүдэд цэнхэр урвалын бүтээгдэхүүн үүсгэдэг.Титрлэлтийг ТУ/мл-ээр гемоцитометр ашиглан LacZ-эерэг эсийн тоог гараар тоолох замаар эсийн өсгөвөрт хийсэн.Тээвэрлэгчийг -80°С хэмд хөргөж, хэрэглэхийн өмнө гэсгээж, CombiMag-тай хольж, 1:1 харьцаатай хольж, хүргэхээс өмнө дор хаяж 30 минутын турш мөсөн дээр өсгөвөрлөнө.
Ердийн Sprague Dawley харх (n = 3/бүлэг, ~2-3 мэдээ алдуулалттай IP 0.4мг/кг медетомидин (Домитор, Илиум, Австрали) ба 60мг/кг кетамин (Илиум, Австрали) 1 сартайд) ip ) тарилгын болон мэс заслын бус амны хөндийн сувгийг 16 Га-ийн судсаар хийх суваг.Гуурсан хоолойн эдийг LV дамжуулалтыг хүлээн авахын тулд гуурсан хоолойн амьсгалын замын гадаргууг утсан сагсаар тэнхлэгийн дагуу үрж (N-Circle, NTSE-022115 үзүүргүй нитинол чулуу олборлогч) өмнө тайлбарласан механик цочролын протоколыг ашиглан нөхцөлийг хангасан. Cook Medical, АНУ) 30 p28.Дараа нь биоаюулгүйн кабинет дахь цочролоос хойш 10 минутын дараа LV-MP-ийн гуурсан хоолойд тарьсан.
Энэ туршилтанд ашигласан соронзон орон нь in vivo рентген судалгаатай адилаар тохируулагдсан бөгөөд ижил соронзыг нэрэх стент хавчаараар гуурсан хоолой дээр байрлуулсан (Зураг 4).50 мкл эзэлхүүнтэй (2 х 25 мкл) LV-MP-ийг өмнө тайлбарласны дагуу гель хэлбэрийн пипетк ашиглан гуурсан хоолойд (n = 3 амьтан) хүргэв.Хяналтын бүлэг (n = 3 амьтан) соронз ашиглахгүйгээр ижил LV-MP хүлээн авсан.Судсаар дууссаны дараа сувгийг дотоод хоолойноос гаргаж аваад амьтныг гадагшлуулна.Соронзыг арилгахаас өмнө 10 минутын турш байрандаа үлдэнэ.Харханд арьсан дор мелоксикам (1 мл/кг) (Ilium, Австрали) тарьж, мэдээ алдуулалтыг зогсоож, 1 мг/кг атипамазол гидрохлорид (Антиседан, Австрали, Австрали) тарьсан.Хархыг дулаацуулж, мэдээ алдуулалтаас бүрэн сэргэх хүртэл ажиглав.
Биологийн аюулгүй байдлын кабинет дахь LV-MP дамжуулах төхөөрөмж.ET хоолойн цайвар саарал Luer-lock ханцуйнаас амнаас цухуйж, зурагт үзүүлсэн гель пипеткийн үзүүрийг ET хоолойгоор дамжуулан гуурсан хоолой руу хүссэн гүнд оруулж байгааг харж болно.
LV-MP эмчилгээний процедурын дараа долоо хоногийн дараа амьтдыг 100% CO2-аар амьсгалж, хүн төрөлхтөнд тахилга хийж, манай стандарт X-gal эмчилгээг ашиглан LacZ-ийн илэрхийлэлийг үнэлэв.Эндотрахеаль гуурсыг байрлуулсны улмаас үүссэн аливаа механик гэмтэл, шингэнийг хадгалахын тулд хамгийн сүүлний мөгөөрсний гурван цагиргийг авч, шинжилгээнд оруулаагүй болно.Гуурсан хоолой бүрийг уртын дагуу зүсэж, хоёр талыг нь гаргаж, силикон резин (Sylgard, Dow Inc) агуулсан аяганд хийж, гэрлийн гадаргууг дүрслэн харуулахын тулд Minutien зүү (Fine Science Tools) ашиглан хийсэн.Хөрвүүлсэн эсийн тархалт, шинж чанарыг DigiLite камер болон TCapture программ (Tucsen Photonics, Хятад) бүхий Nikon микроскоп (SMZ1500) ашиглан урд талын гэрэл зургаар баталгаажуулсан.Зургийг 20 дахин томруулж (гуурсан хоолойн өргөний хамгийн дээд тохиргоог оруулаад) авсан бөгөөд гуурсан хоолойн бүхэл бүтэн уртыг алхам алхмаар харуулсан бөгөөд зураг бүрийн хооронд хангалттай давхцаж, зургийг "оёх" боломжтой болгосон.Дараа нь цагаан мөгөөрсөн хоолой бүрээс авсан зургуудыг хавтгай хөдөлгөөний алгоритмыг ашиглан Composite Image Editor хувилбар 2.0.3 (Microsoft Research) ашиглан нэг нийлмэл зураг болгон нэгтгэв. Амьтан бүрийн цагаан мөгөөрсөн хоолойн нийлмэл зураг доторх LacZ илэрхийллийн талбайг өмнө тайлбарласны дагуу автоматжуулсан MATLAB скрипт (R2020a, MathWorks) ашиглан 0.35 < Өнгөний < 0.58, Ханалт > 0.15, Утга < 0.7 гэсэн тохиргоог ашиглан хэмжсэн. Амьтан бүрийн цагаан мөгөөрсөн хоолойн нийлмэл зураг доторх LacZ илэрхийллийн талбайг өмнө тайлбарласны дагуу автоматжуулсан MATLAB скрипт (R2020a, MathWorks) ашиглан 0.35 < Hue < 0.58, Ханалт > 0.15, Утга < 0.7 гэсэн тохиргоог ашиглан хэмжсэн. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена нь автоматжуулсан хувилбар MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с настрощенность <50, 0,15 ба тэмдэглэгээ <0 ,7. Амьтан бүрийн гуурсан хоолойн нийлмэл зураг дээрх LacZ илэрхийллийн талбайг өмнө тайлбарласны дагуу автоматжуулсан MATLAB скрипт (R2020a, MathWorks) ашиглан 0.35 тохиргоог ашиглан хэмжсэн.0.15 ба утга<0 .7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图图图国行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复所 气管 复所表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 ………………………………………… Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли нь автоматжуулсан сценари MATLAB (R2020a, MathWorks), хэрхэн описано ранее, ашиглах настроек50, настроек 80, значение <0,7 . Амьтан бүрийн цагаан мөгөөрсөн хоолойн нийлмэл зураг дээрх LacZ-ийн илэрхийлэлийн хэсгүүдийг 0.35 < өнгөний < 0.58, ханалт > 0.15 ба < 0.7 утгыг ашиглан өмнө тайлбарласны дагуу автоматжуулсан MATLAB скрипт (R2020a, MathWorks) ашиглан хэмжсэн.GIMP v2.10.24-д эд эсийн контурыг хянаснаар нийлмэл зураг тус бүрд гар аргаар маск үүсгэсэн бөгөөд эд эсийн хэсгийг тодорхойлж, гуурсан хоолойн эдээс гадуур аливаа хуурамч илрүүлэлтээс сэргийлсэн.Амьтан бүрээс авсан бүх нийлмэл зургийн будагдсан талбайг нэгтгэн тухайн амьтны нийт будсан талбайг гаргав.Дараа нь будсан хэсгийг маскны нийт талбайд хувааж, хэвийн талбайг олж авна.
Гуурсан хоолой бүрийг парафинд шингээж, 5 μм зузаантай хэсэг болгон хуваасан.Хэсгүүдийг саармаг улаан өнгөөр ​​5 минутын турш будаж, Nikon Eclipse E400 микроскоп, DS-Fi3 камер болон NIS элементийн бичлэгийн программ (хувилбар 5.20.00) ашиглан зургийг авсан.
Бүх статистик шинжилгээг GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) дээр хийсэн.Статистикийн ач холбогдлыг p ≤ 0.05 гэж тогтоосон.Хэвийн байдлыг Шапиро-Вилк тестээр шалгаж, LacZ будгийн ялгааг хосгүй t-тест ашиглан үнэлэв.
Хүснэгт 1-д тодорхойлсон зургаан УИХ-ын гишүүнийг PCXI-ээр шалгасан бөгөөд харагдах байдлыг Хүснэгт 2-т үзүүлэв. Хоёр полистирол MP-ийг (MP1 ба MP2; 18 µm ба 0.25 µm тус тус) PCXI-д харагдахгүй байсан ч үлдсэн дээжийг тодорхойлох боломжтой байв. (жишээг 5-р зурагт үзүүлэв).MP3 ба MP4 нь сул харагддаг (10-15% Fe3O4; 0.25 μm ба 0.9 µm тус тус).Хэдийгээр MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) нь туршилтанд хамрагдсан хамгийн жижиг хэсгүүдийг агуулж байсан ч энэ нь хамгийн тод харагдаж байсан.CombiMag MP6 бүтээгдэхүүнийг ялгахад хэцүү байдаг.Бүх тохиолдолд соронзыг хялгасан судастай параллель нааш цааш хөдөлгөснөөр MF-ийг илрүүлэх чадвар маань ихээхэн сайжирсан.Соронзууд хялгасан судаснаасаа холдох үед хэсгүүд нь урт гинжээр суга татагдсан боловч соронз ойртож, соронзон орны хүч нэмэгдэхийн хэрээр бөөмсүүд хялгасан судасны дээд гадаргуу руу шилжих үед бөөмийн гинж богиноссон (Нэмэлт видео S1-г үзнэ үү) : MP4), гадаргуу дээрх бөөмийн нягтыг нэмэгдүүлэх.Үүний эсрэгээр, соронзыг капилляраас салгахад талбайн хүч буурч, парламентын гишүүд хялгасан судасны дээд гадаргуугаас урт гинж болж өөрчлөгддөг (Нэмэлт видео S2: MP4-ийг үзнэ үү).Соронз хөдлөхөө больсны дараа бөөмс тэнцвэрийн байрлалд хүрсний дараа хэсэг хугацаанд хөдөлсөөр байна.МП нь хялгасан судасны дээд гадаргуу руу болон түүнээс холдох үед соронзон хэсгүүд нь шингэнээр дамжин хог хаягдлыг татах хандлагатай байдаг.
PCXI-ийн дагуу MP-ийн харагдах байдал нь дээжийн хооронд ихээхэн ялгаатай байдаг.(a) MP3, (б) MP4, (в) MP5 ба (г) MP6.Энд үзүүлсэн бүх зургийг капилляраас шууд 10 мм-ийн зайд байрлуулсан соронзоор авсан.Харагдах том тойрог нь хялгасан судсанд баригдсан агаарын бөмбөлгүүд бөгөөд фазын тодосгогч зургийн хар, цагаан ирмэгийн онцлогийг тодорхой харуулдаг.Улаан хайрцаг нь тодосгогчийг нэмэгдүүлдэг томруулагчийг заана.Бүх зураг дээрх соронзон хэлхээний диаметр нь масштабтай биш бөгөөд зурагт үзүүлсэнээс ойролцоогоор 100 дахин их байгааг анхаарна уу.
Соронз нь капиллярын дээд хэсгийн дагуу баруун, зүүн тийш хөдөлж байх үед МП утаснуудын өнцөг нь соронзтой таарч өөрчлөгддөг (Зураг 6-г үз), ингэснээр соронзон орны шугамыг заана.MP3-5-ын хувьд хөвч нь босго өнцөгт хүрсний дараа хэсгүүд нь хялгасан судасны дээд гадаргуугийн дагуу чирдэг.Энэ нь ихэвчлэн парламентын гишүүд соронзон орон хамгийн хүчтэй байдаг газрын ойролцоо том бүлэгт хуваагдахад хүргэдэг (Нэмэлт видео S3: MP5-ыг үзнэ үү).Энэ нь ялангуяа капиллярын төгсгөлд ойртож зураг авах үед тод илэрдэг бөгөөд энэ нь МП нь шингэн-агаарын интерфейс дээр хуримтлагдаж, төвлөрөхөд хүргэдэг.MP3-5-аас ялгахад хэцүү байсан MP6 дахь хэсгүүд нь соронзон хялгасан судасны дагуу хөдөлж байх үед чирэгдэлгүй, харин MP утас нь салж, бөөмсийг харна уу (Нэмэлт видео S4: MP6-г үзнэ үү).Зарим тохиолдолд соронзон орныг дүрслэх газраас хол зайд хөдөлгөж хэрэглэсэн соронзон орон багассан үед үлдсэн парламентын гишүүд таталцлын нөлөөгөөр хоолойн доод гадаргуу руу аажмаар доошилж, утсанд үлддэг (Нэмэлт видео S5: MP3-ыг үзнэ үү) .
Соронз нь хялгасан судас дээгүүр баруун тийш шилжих үед MP утасны өнцөг өөрчлөгддөг.(a) MP3, (б) MP4, (в) MP5 ба (г) MP6.Улаан хайрцаг нь тодосгогчийг нэмэгдүүлдэг томруулагчийг заана.Нэмэлт видеонууд нь эдгээр статик зургуудад харагдахуйц чухал бөөмийн бүтэц, динамик мэдээллийг илчлэх тул мэдээллийн зорилгоор хийгдсэн болохыг анхаарна уу.
Соронзыг гуурсан хоолойн дагуу нааш цааш аажуухан хөдөлгөх нь in vivo нарийн төвөгтэй хөдөлгөөний нөхцөлд MF-ийн дүрслэлийг хөнгөвчлөхийг бидний туршилт харуулсан.Полистирол бөмбөлгүүдийг (MP1 ба MP2) хялгасан судсанд харагдахгүй байсан тул in vivo туршилт хийгдээгүй.Үлдсэн дөрвөн MF тус бүрийг соронзны урт тэнхлэгийг гуурсан хоолойн дээгүүр босоо тэнхлэгээс 30°-ын өнцгөөр байрлуулсан (Зураг 2b ба 3a-г үзнэ үү) in vivo байдлаар туршсан бөгөөд энэ нь MF гинжийг уртасгаж, илүү үр дүнтэй байсан. соронзоос илүү..тохиргоо дуусгавар болсон.Амьд амьтдын цагаан мөгөөрсөн хоолойд MP3, MP4, MP6 олдсонгүй.Амьтдыг хүнээр хөнөөсөн хархуудын амьсгалын замыг дүрслэн харахад тариурын шахуурга ашиглан нэмэлт хэмжээ нэмсэн ч тоосонцор нь үл үзэгдэх хэвээр байв.MP5 нь төмрийн ислийн хамгийн өндөр агууламжтай бөгөөд харагдахуйц цорын ганц тоосонцор байсан тул үүнийг in vivo MP-ийн зан төлөвийг үнэлэх, тодорхойлоход ашигласан.
MF оруулах үед соронзыг гуурсан хоолой дээр байрлуулах нь олон тооны MF-ийг бүхэлд нь биш харин харааны талбарт төвлөрүүлэхэд хүргэсэн.Мөгөөрсөн хоолойд бөөмс орох нь хүний ​​аргаар устгасан амьтдад хамгийн сайн ажиглагддаг.Зураг 7 ба нэмэлт видео S6: MP5 нь ховдолын гуурсан хоолойн гадаргуу дээрх хэсгүүдийн хурдацтай соронзон барьж, зэрэгцэж байгааг харуулсан нь парламентын гишүүдийг гуурсан хоолойн хүссэн хэсэгт чиглүүлэх боломжтойг харуулж байна.MF-ийг хүргэсний дараа гуурсан хоолойн дагуу илүү алслагдсан хэсгийг хайж олоход зарим MF-ийг карина руу ойртуулсан нь бүх MF-ийг цуглуулж, барихад соронзон орны хүч хангалтгүй байгааг харуулж байна, учир нь тэдгээр нь шингэний хэрэглээний үед соронзон орны хамгийн их хүчтэй бүсээр дамждаг.үйл явц.Гэсэн хэдий ч төрсний дараах үеийн MP-ийн концентраци нь зургийн талбайн эргэн тойронд илүү өндөр байсан нь соронзон орны хүч хамгийн их байдаг амьсгалын замын бүсэд парламентын олон гишүүн үлдсэнийг харуулж байна.
Саяхан устгасан хархны цагаан мөгөөрсөн хоолойд MP5-ийг хүргэхээс өмнө ба (б) дүрсний талбайн дээр байрлуулсан соронз бүхий зургууд.Дүрслэгдсэн хэсэг нь хоёр мөгөөрсний цагиргийн хооронд байрладаг.УИХ-ын гишүүнийг хүргэхээс өмнө амьсгалын замд шингэн байдаг.Улаан хайрцаг нь тодосгогчийг нэмэгдүүлдэг томруулагчийг заана.Эдгээр зургуудыг S6: MP5 нэмэлт видеонд үзүүлсэн видеоноос авсан болно.
Соронзыг гуурсан хоолойн дагуу in vivo хөдөлгөснөөр амьсгалын замын гадаргуу дээрх МП гинжин хэлхээний өнцгийг хялгасан судсанд ажиглагдсантай адил өөрчилсөн (Зураг 8 болон Нэмэлт видео S7: MP5-ыг үзнэ үү).Гэсэн хэдий ч бидний судалгаагаар парламентын гишүүдийг хялгасан судаснууд шиг амьд амьсгалын замын гадаргуугийн дагуу чирэх боломжгүй байв.Зарим тохиолдолд соронз зүүн, баруун тийш шилжих үед MP гинж уртасдаг.Сонирхолтой нь бид соронзыг гуурсан хоолойн дагуу уртааш нь хөдөлгөхөд шингэний гадаргуугийн давхаргын гүнийг өөрчилдөг ба соронзыг шууд дээгүүр хөдөлгөж, бөөмийн гинжийг босоо байрлалд эргүүлэхэд тэлдэг болохыг олж мэдсэн (харна уу). Нэмэлт видео S7).: MP5 0:09, баруун доод талд).Соронзыг гуурсан хоолойн дээд талд (өөрөөр хэлбэл, гуурсан хоолойн уртын дагуу биш харин амьтны зүүн эсвэл баруун тийш) хажуу тийш шилжүүлэх үед хөдөлгөөний онцлог шинж чанар өөрчлөгдсөн.Хөдөлгөөний явцад бөөмсүүд тод харагдаж байсан ч гуурсан хоолойноос соронзыг салгахад бөөмийн утаснуудын үзүүрүүд харагдах болсон (Нэмэлт видео S8: MP5, 0:08-аас эхлэн үзнэ үү).Энэ нь шилэн хялгасан судсанд хэрэглэсэн соронзон орны нөлөөн дор соронзон орны ажиглагдсан зан төлөвтэй тохирч байна.
Амьд мэдээгүйжүүлсэн хархны цагаан мөгөөрсөн хоолойд MP5-ийг харуулсан жишээ зураг.(a) Соронз нь цагаан мөгөөрсөн хоолойн дээр болон зүүн талд, дараа нь (б) соронзыг баруун тийш шилжүүлсний дараа дүрсийг авахад ашиглагддаг.Улаан хайрцаг нь тодосгогчийг нэмэгдүүлдэг томруулагчийг заана.Эдгээр зургуудыг S7-ийн нэмэлт видео: MP5-д үзүүлсэн видеоноос авсан болно.
Хоёр туйлыг гуурсан хоолойн дээр ба доор хойд-өмнөд чиглүүлэн тохируулахад (өөрөөр хэлбэл татах; Зураг 3б) МП хөвч урт гарч, гуурсан хоолойн нурууны гадаргуу дээр биш харин гуурсан хоолойн хажуугийн хананд байрладаг байв. гуурсан хоолой (Хавсралтыг үзнэ үү).Видео S9: MP5).Гэсэн хэдий ч, ихэвчлэн нэг соронзтой төхөөрөмжтэй хамт тохиолддог хос соронзтой төхөөрөмж ашиглан шингэнийг хэрэглэсний дараа нэг цэг дээр бөөмсийн өндөр концентраци (өөрөөр хэлбэл гуурсан хоолойн нурууны гадаргуу) илрээгүй.Дараа нь нэг соронзыг эсрэг туйлуудыг түлхэхээр тохируулсан үед (Зураг 3c) хүргэлтийн дараа харагдах талбарт харагдах бөөмсийн тоо нэмэгдээгүй.Хоёр соронзны тохиргоог хоёуланг нь тохируулах нь соронзон орны өндөр хүч чадалтай тул соронзыг татдаг эсвэл түлхэдэг тул хэцүү байдаг.Дараа нь уг тохиргоог амьсгалын замтай параллель дан соронз болгон өөрчилсөн боловч 90 градусын өнцгөөр амьсгалын замаар дамждаг бөгөөд ингэснээр хүчний шугамууд гуурсан хоолойн ханыг эгц хөндлөн огтолжээ (Зураг 3d), энэ нь бөөмс бөөгнөрөх боломжийг тодорхойлох зорилготой юм. хажуугийн хана.ажиглах.Гэсэн хэдий ч, энэ тохиргоонд MF хуримтлагдах хөдөлгөөн эсвэл соронзны хөдөлгөөнийг тодорхойлох боломжгүй байсан.Эдгээр бүх үр дүнд үндэслэн генийн тээвэрлэгчдийн in vivo судалгаанд зориулж нэг соронзтой, 30 градусын чиг баримжаа бүхий тохиргоог сонгосон (Зураг 3a).
Амьтныг хүнээр тахилга гаргасны дараа шууд олон удаа дүрсэлсэн үед хөндлөнгийн эдийн хөдөлгөөн байхгүй байсан нь мөгөөрс хоорондын тунгалаг талбарт жижиг хэсгүүдийн нарийн, богино шугамууд соронзны хөрвүүлэлтийн хөдөлгөөний дагуу "ганхаж" байгааг анзаарах боломжтой болсон.MP6 тоосонцор байгаа байдал, хөдөлгөөнийг тодорхой хараарай.
LV-LacZ-ийн титр нь 1.8 x 108 IU/мл байсан бөгөөд CombiMag MP (MP6) -тай 1: 1 харьцаатай холилдсоны дараа амьтдад 50 мкл гуурсан хоолойн 9 x 107 IU/ml LV тээврийн хэрэгсэл (өөрөөр хэлбэл 4.5) тарьсан. x 106 TU/харх).).).Эдгээр судалгаанууд дээр бид хөдөлмөрийн үед соронзыг хөдөлгөхийн оронд соронзыг нэг байрлалд бэхэлсэн бөгөөд (а) соронзон орон байхгүй үед вектор дамжуулалттай харьцуулахад LV дамжуулалтыг сайжруулах боломжтой эсэхийг, мөн (б) амьсгалын зам боломжтой эсэхийг тодорхойлохын тулд соронзыг нэг байрлалд суулгасан. анхаарлаа төвлөрүүлэх.Амьсгалын дээд замын соронзон зорилтот хэсэгт дамждаг эсүүд.
Соронзон байгаа эсэх, CombiMag-ийг LV вектортой хослуулан хэрэглэх нь манай стандарт LV вектор дамжуулах протоколын адил амьтны эрүүл мэндэд сөргөөр нөлөөлөөгүй.Механик цочролд өртсөн гуурсан хоолойн урд талын зургуудаас (Нэмэлт зураг 1) LV-MP эмчилгээ хийлгэсэн бүлэг нь соронзон байгаа нөхцөлд дамжуулалтын түвшин мэдэгдэхүйц өндөр байгааг харуулсан (Зураг 9a).Хяналтын бүлэгт зөвхөн бага хэмжээний хөх өнгийн LacZ будалт байсан (Зураг 9б).Х-Галаар будсан хэвийн бүсүүдийн тоон үзүүлэлт нь соронзон орны дэргэд LV-MP-ийг хэрэглэснээр ойролцоогоор 6 дахин сайжирсан (Зураг 9c).
Соронзон орон байгаа үед LV-MP (a) ба (б) соронзон байхгүй үед гуурсан хоолойн дамжуулалтыг харуулсан нийлмэл зургийн жишээ.(в) Соронзон ашиглан цагаан мөгөөрсөн хоолой дахь LacZ дамжуулалтын хэвийн талбайн статистикийн хувьд мэдэгдэхүйц сайжирсан (*p = 0.029, t-тест, бүлэг тус бүрт n = 3, дундаж ± стандарт алдаа).
Төвийг сахисан хурдан улаанаар будсан хэсгүүд (нэмэлт зураг 2-т үзүүлсэн жишээ) нь LacZ-ээр будсан эсүүд өмнө нь мэдээлсэнтэй ижил дээжинд, ижил байршилд байгааг харуулж байна.
Амьсгалын замын генийн эмчилгээний гол сорилт бол тээвэрлэгч тоосонцорыг сонирхож буй газруудад нарийн нутагшуулах, агаарын урсгал болон салстыг идэвхтэй цэвэрлэх үед хөдөлгөөнт уушгинд дамжуулалтын өндөр үр ашигтай байдалд хүрэх явдал хэвээр байна.Цистик фиброзын үед амьсгалын замын өвчнийг эмчлэх зориулалттай LV тээгчдийн хувьд дамжуулагч амьсгалын замд тээвэрлэгч хэсгүүдийн оршин суух хугацааг нэмэгдүүлэх нь өнөөг хүртэл биелэх боломжгүй зорилт байсаар ирсэн.Кастеллани нар тэмдэглэснээр дамжуулалтыг сайжруулахын тулд соронзон орныг ашиглах нь энгийн, хэмнэлттэй, орон нутгийн чанартай хүргэх, үр ашгийг нэмэгдүүлэх, инкубацийн хугацааг богиносгох зэрэг бусад ген дамжуулах аргуудаас давуу талтай байдаг.мөн тээврийн хэрэгслийн бага тунтай байж магадгүй10.Гэсэн хэдий ч гадны соронзон хүчний нөлөөн дор амьсгалын замд соронзон хэсгүүдийн in vivo хуримтлал, зан төлөвийг хэзээ ч тайлбарлаагүй бөгөөд үнэн хэрэгтээ энэ аргын амьд амьсгалын замд генийн илэрхийлэлийн түвшинг нэмэгдүүлэх чадварыг in vivo харуулаагүй болно.
Бидний PCXI синхротрон дээр хийсэн in vitro туршилтууд нь бидний ашигласан дүрслэлийн тохиргоонд MP полистиролоос бусад бүх тоосонцор харагдаж байгааг харуулсан.Соронзон орон байгаа үед соронзон орон нь утас үүсгэдэг бөгөөд тэдгээрийн урт нь бөөмсийн төрөл, соронзон орны хүч (өөрөөр хэлбэл, соронзны ойролцоо, хөдөлгөөн) -ээс хамаардаг.Зураг 10-д үзүүлсэнчлэн, бидний ажиглаж буй утаснууд нь бие даасан бөөмс бүр соронздож, өөрийн орон нутгийн соронзон орныг үүсгэснээр үүсдэг.Эдгээр салангид талбарууд нь бусад бөөмсийг татах, түлхэх орон нутгийн хүчний нөлөөгөөр бусад ижил төстэй бөөмсийг цуглуулж, бүлгийн утаснуудын хөдөлгөөнтэй холбоход хүргэдэг.
Диаграмм (a, b) шингэнээр дүүрсэн хялгасан судас болон (в, г) агаараар дүүрсэн гуурсан хоолойн дотор үүссэн бөөмсийн гинжийг харуулсан.Капилляр болон цагаан мөгөөрсөн хоолой нь масштабаар татагдахгүй гэдгийг анхаарна уу.(a) самбарт гинжээр байрлуулсан Fe3O4 тоосонцор агуулсан MF-ийн тодорхойлолтыг агуулна.
Соронз хялгасан судас дээгүүр хөдөлж байх үед бөөмийн хэлхээний өнцөг Fe3O4 агуулсан MP3-5-ын эгзэгтэй босгонд хүрч, дараа нь бөөмийн утас анхны байрлалдаа үлдэхээ больж, гадаргуугийн дагуу шинэ байрлал руу шилжсэн.соронз.Шилэн хялгасан судасны гадаргуу нь энэ хөдөлгөөнийг бий болгоход хангалттай гөлгөр байдаг тул ийм нөлөөлөл үүсдэг.Сонирхолтой нь MP6 (CombiMag) нь ийм байдлаар хандаагүй, магадгүй бөөмс нь жижиг, өөр бүрхүүл эсвэл гадаргуугийн цэнэгтэй байсан, эсвэл өмчлөлийн тээвэрлэгч шингэн нь тэдний хөдлөх чадварт нөлөөлсөн байж магадгүй юм.CombiMag бөөмийн зураг дээрх тодосгогч нь мөн сул байгаа нь шингэн ба бөөмс нь ижил нягттай байж болох тул бие бие рүүгээ амархан хөдөлж чадахгүй байгааг харуулж байна.Соронз хэт хурдан хөдөлвөл бөөмс гацах боломжтой бөгөөд энэ нь соронзон орны хүч нь шингэн дэх хэсгүүдийн хоорондох үрэлтийг үргэлж даван туулж чадахгүй гэдгийг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь соронзон орны хүч болон соронз ба зорилтот хэсгийн хоорондох зайд гацах ёсгүйг харуулж байна. гэнэтийн.чухал.Эдгээр үр дүн нь хэдийгээр соронз нь зорилтот хэсэгт урсаж буй олон бичил хэсгүүдийг барьж чаддаг ч гуурсан хоолойн гадаргуугийн дагуу CombiMag тоосонцорыг хөдөлгөхөд соронзонд найдаж болохгүй гэдгийг харуулж байна.Тиймээс бид in vivo LV MF судалгаанд амьсгалын замын модны тодорхой хэсгийг физик байдлаар чиглүүлэхийн тулд статик соронзон орныг ашиглах ёстой гэж бид дүгнэсэн.
Бие махбодид бөөмсийг оруулсны дараа тэдгээрийг биеийн нарийн төвөгтэй хөдөлж буй эд эсийн нөхцөлд тодорхойлоход хэцүү байдаг ч МР-ийн утсыг "давхих" зорилгоор соронзыг гуурсан хоолойн дээгүүр хэвтээ байдлаар хөдөлгөснөөр илрүүлэх чадварыг сайжруулсан.Бодит цагийн дүрслэл хийх боломжтой боловч амьтныг хүний ​​гараар устгасны дараа бөөмийн хөдөлгөөнийг ялгахад хялбар байдаг.Соронзыг дүрслэх хэсэг дээр байрлуулсан үед MP-ийн концентраци ихэвчлэн хамгийн өндөр байсан ч зарим тоосонцор ихэвчлэн гуурсан хоолойн доороос олддог.In vitro судалгаанаас ялгаатай нь тоосонцорыг соронзны хөдөлгөөнөөр гуурсан хоолой руу татах боломжгүй.Энэхүү олдвор нь гуурсан хоолойн гадаргууг бүрхсэн салиа нь ихэвчлэн амьсгалсан тоосонцорыг хэрхэн боловсруулж, салст бүрхэвчинд барьж, улмаар салст бүрхүүлийн цэвэрлэгээний механизмаар дамжуулан цэвэрлэдэгтэй нийцэж байна.
Гуурсан хоолойн дээгүүр ба доор соронзыг татахад ашиглах нь (Зураг 3б) нэг цэгт өндөр төвлөрч буй соронзон орон биш харин илүү жигд соронзон орон үүсгэж, бөөмсийн жигд тархалтыг бий болгож болзошгүй гэж бид таамагласан..Гэсэн хэдий ч бидний урьдчилсан судалгаагаар энэ таамаглалыг батлах тодорхой нотлох баримт олдсонгүй.Үүний нэгэн адил, түлхэх хос соронзыг тохируулснаар (Зураг 3c) дүрсний хэсэгт бөөмс илүү тогтохгүй.Эдгээр хоёр олдвор нь хос соронзтой тохируулга нь МП заагчийн орон нутгийн удирдлагыг төдийлөн сайжруулдаггүй бөгөөд үүнээс үүдэн бий болох хүчтэй соронзон хүчийг тохируулахад хүндрэлтэй байгаа нь энэ хандлагыг илүү практик болгож байгааг харуулж байна.Үүний нэгэн адил соронзыг гуурсан хоолойн дээгүүр болон хөндлөн чиглүүлснээр (Зураг 3d) зураг авсан хэсэгт үлдсэн хэсгүүдийн тоог нэмэгдүүлээгүй.Эдгээр хувилбаруудын зарим нь тунадасны бүсийн соронзон орны хүчийг бууруулдаг тул амжилтанд хүрэхгүй байж магадгүй юм.Тиймээс 30 градусын нэг соронзны тохиргоо (Зураг 3a) нь in vivo туршилтын хамгийн энгийн бөгөөд үр дүнтэй арга гэж тооцогддог.
LV-MP-ийн судалгаагаар LV векторуудыг CombiMag-тай нэгтгэж, соронзон орны дэргэд бие махбодид саад учруулсны дараа хүргэх үед гуурсан хоолойн дамжуулалтын түвшин хяналттай харьцуулахад мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн болохыг харуулсан.Синхротрон дүрслэлийн судалгаа болон LacZ-ийн үр дүнд үндэслэн соронзон орон нь гуурсан хоолойд LV-ийг хадгалж, уушгины гүн рүү нэн даруй нэвтэрсэн вектор хэсгүүдийн тоог бууруулж чадсан юм.Ийм зорилтот сайжруулалт нь хүргэсэн титр, зорилтот бус дамжуулалт, үрэвслийн болон дархлааны гаж нөлөө, ген шилжүүлгийн зардлыг бууруулахын зэрэгцээ үр ашгийг нэмэгдүүлэхэд хүргэдэг.Хамгийн чухал нь үйлдвэрлэгчийн үзэж байгаагаар CombiMag-ийг бусад вирусын векторууд (AAV гэх мэт) болон нуклейн хүчлүүд зэрэг бусад ген дамжуулах аргуудтай хослуулан хэрэглэж болно.